Nuclear Magnetic Resonance (NMR)

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) adalah salah satu metode analisis yang paling mudah digunakan pada kimia modern. NMR digunakan untuk menentukan struktur dari komponen alami dan sintetik yang baru, kemurnian dari komponen, dan arah reaksi kimia sebagaimana hubungan komponen dalam larutan yang dapat mengalami reaksi kimia [1,2]. Meskipun banyak jenis nucleiyang berbeda akan menghasilkan spektrum, nuclei hidrogen (H) secara histori adalah salah satu yang paling sering diamati. Spektrokopi NMR khususnya digunakan pada studi molekul organik karena biasanya membentuk atom hidrogen dengan jumlah yang sangat besar [3,4,5,6].
Pada spektrum hidrogen NMR menghadirkan beberapa resonansi yang menjelaskan pertama bahwa molekul yang dipelajari mengandung hidrogen. Kedua, jumlah pita dalam spektrum menunjukkan bagaimana beberapa posisi yang berbeda pada molekul dimana hidrogen melekat/menempel. Frekuensi dari beberapa resonansi utama pada spektrum NMR menunjukkan perubahan kimia. Ini sangat penting untuk menduga bagian dari spektrum NMR yang mengandung informasi tentang lingkungan masing-masing atom hidrogen dan struktur dari komponen yang dipelajari. Informasi ketiga bahwa sebuah spektrum NMR menentukan perbandingan luas/daerah pita yang berbeda, ini menjelaskan jumlah atom hidrogen yang relatif yang keluar pada masing-masing posisi pada molekul yang diperoleh. Perbandingan ini petunjuk/bukti langsung struktur dari struktur molekul dan harus mutlak sesuai untuk beberapa struktur yang diusulkan sebelum struktur tersebut kemungkinan dipertimbangkan benar.


Struktur kompleks pita-pita dapat mengandung informasi tentang jarak yang memisahkan beberapa atom hidrogen yang melewati ikatan kovalen dan penyusun spasial atom hidrogen yang melekat pada molekul, termasuk struktur dasarnya. Struktur dasar menunjukkan pembungkusan atau penggabungan molekul yang memiliki ikatan yang panjang, seperti struktur spiral DNA. Struktur kompleks pita NMR pada mulanya spin coupling diantara beberapa atom hidrogen. Penggabungan ini merupakan perputaran fungsi jarak melintasi ikatan dan geometri molekul. Dalam kasus molekul kecil, pita yang kompleks mungkin disimulasikan tepat dengan perhitungan mekanika kuantum atau didekati menggunakan mekanika kuantum yang sesuai dengan aturan.
Spektroskopi NMR merupakan alat yang dikembangkan dalam biologi struktural. NMR manjadi sebuah teknik alternatif selain kristalografi X-Ray, untuk memperoleh informasi struktur dan resolusi dinamik atomik dan studi interaksi molekuler dari makromolekul biologi pada kondisi larutan secara fisiologi [7]. Usaha sangat penting untuk memperluas aplikasi NMR untuk sistem molekul yang lebih besar, karena jumlah yang lebih besar secara biologi dibutuhkan kompleks makromolekul dan makromolekuler yang memiliki massa molekuler melebihi range yang sacara prakis digunakan untuk spektroskopi NMR konvensional dalam larutan. Peningkatan ukuran ini memberikan batasan, contohnya, penentuan struktur protein yang tidak dapat dikristalkan, termasuk membran protein integral, penelitian interaksi molekuler melibatkan molekul besar dan penghimpunan makromolekuler, dan penentuan struktur dari oligonukleotida yang lebih besar dan kompleks dengan protein.
Untuk protein dan protein komplek dengan massa molekuler sekitar 25-30 kDa kualitas spektra menurun dengan cepat membatasi mayor A ketika bekerja dengan makromolekul besar yang berasal dari kecepatan relaksasi tinggi signal NMR [7,8], menyebabkan garis tajam yang melebar, yang berpindah menuju resolusi spektra yang lebih sedikit dan perbandingan signal-to-noise yang rendah. Banyak peningkatan kualitas spektra NMR dari biologi makromolekuler dengan massa molekuler sekitar diatas 25 kDa dapat diperoleh dengan deuterasi, teknik yang telah dipakai dalam biologi NMR selama lebih dari 30 tahun. Dikombinasikan dengan label 15N dan 13C, label 2H mengalami pemulihan yang sangat mengesankan sekitar 10 tahun yang lalu dan telah menjadi alat yang paling penting untuk menentukan struktur yang lebih besar dalam larutan.

Signal NMR

Mengukur respon NMR dari spin nuklir yang besar, gangguan medan magnetik homogen disebabkan oleh iradiasi medan elektromagnetik dalam wilayah frekuensi radio [7]. Dalam prakteknya, digunakan rangkaian pulsa frekuensi radio, dengan pulsa yang dipisahkan oleh periode waktu interpulsa. Respon untuk rangkaian pulsa NMR adalah jumlah dari frekuensi radio yang telah dipancarkan oleh nuclei.
Signal NMR meluruh secara eksponensial dengan karakteristik konstanta waktu, waktu relaksasi transverse T2 (Gambar 1, kasus A). Untuk analisis, signal transport Fourier ke dalam spektrum yang mengandung garis resonansi yang menunjukkan beberapa frekuensi radio. Lebar dari garis resonansi pada spektrum secara terbalik sesuai dengan T2. Waktu relaksasitransverse T2 bergantung pada ukuran molekul untuk meningkatkan massa molekuler, T2 menjadi lebih pendek (relaksasi transverse yang cepat) dan akibatnya garis pada spektrum melebar (Gambar 1, kasus B). Relaksasitransverse merupakan alasan utama untuk membatasi massa molekul kecil secara relatif pada standar larutan NMR.
Ketika meneliti molekul besar dengan metode NMR larutan, biasanya ada tiga kesulitan yang timbul yaitu signal overlap, relaksasi tranverse yang cepat, danlimited solubility[7].
1. Jumlah resonansi yang besar dapat menyebabkan signal overlap, yang dapat membuat analisis dari spektra sangat sulit untuk dikerjakan. Signal spektroskopi NMR yang overlap dapat dikurangi dengan pemilihan skema isotope-labeling yang sesuai.
2. Transverse magnetisasi pada molekul yang besar melemah lebih cepat, yang menempati lebar garis dan sinsitivitas yang lemah pada spektra, dan akhirnya tidak ada signal NMR yang dapat dideteksi.
3. Dengan meningkatnya massa molekuler dari makromolekuler, solubilitasnya menurun, mengurangi signal per satuan volum. Perkembangan terbaru teknik NMR dan instrumentasi yang meningkatkan sinsitivitas berperan dalam mengurangi isu ini

Gambar 1. Spektroskopi NMR larutan dengan molekul kecil dan besar. A) signal NMR diperoleh dari molekul kecil dalam larutan yang berelaksasi secara perlahan, yang memiliki transverse waktu relaksasi yan panjang T2. Nilai pindah T2 lebih panjang dalam lebar garis yang sempit (Δv) pada spektrum NMR setelah transfor Fourier signal NMR. HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation)ditempatkan untuk rangkaian pulsa yang digunakan. B) untuk molekul besar peluruhan signal NMR lebih cepat (T2 lebIh kecil). Hasilnya pada signal yang lemah diukur setelah rangkaian pulsa NMR dan pada lebar garis dalam spektra. Pada struktur skematik pada sisi kiri, densitas yang tinggi dari proton menunjukkan titik hitam (black dots). C) Dengan deuterasi makromolekul (mengurangi jumlah proton ditunjukkan oleh jumlah black dots yang lebih sedikit dalam struktur skematik). Relaksasi transverse dapat menurun dalam jumlah yang besar, yang hasilnya meningkatkan resolusi spektra dan meningkatkan sinsitivitas untuk molekul yang lebih besar. D) Dengan rangkaian pulsaTransverse Relaxation-Optimized Spectroscopy (TROSY) pada deuterasi contoh makromolekuler transverse relaksasi dapat menurun lebih cepat, dengan cara lebih meningkatkan massa molekuler yang sesuai dengan NMR.

Labelling Isotop

Sumber utama untuk transverse relaksasi adalah proton dan adanya atom hidrogen. Melalui interaksi dipol-dipol (DD)[7] mereka melemahkan nuclei NMR-aktif secara efisien contohnya 1H, 13C atau 15N dalam makromolekuler. Kekuatan dari interaksi DD bergantung pada tipe nukleus dan dapat menurun dengan cepat dengan mengganti proton dengan deuteron (deuterasi), karena secara signifikan perbandingan geometriknya lebih rendah.γ dari 2H dibandingkan dengan 1H. Proton dalam grup amida protein deuterasinya lebih tinggi terutama sederhana dan secara umum diperlukan hanya untuk menghilangkan H2O. Perubahan grup 15N-1H akan menjadi proton dan secara strategis grup amida yang penting pada backbone polipeptida protein akan dapat diterima untuk eksperimen NMR.

Aplikasi NMR

Studi Larutan NMR pada Protein Membran
Protein membran berperan pada beberapa fungsi fisiologi yang penting, dan dalam membentuk kunci target obat-obatan. Studi struktural protein membran oleh X-ray crystallography atau oleh NMR spektrokopi lebih sulit dari pada untuk protein yang dapat dilarutkan [7]. Karena sistem membran yang nyata terlalu besar untuk diteliti dengan ekperimen larutan NMR, protein membran sering diencerkan dalam detergen micelles. Dari system micellar,spektra dapat diperoleh menggunakan TROSY (Transverse Relaxation-Optimized Spectroscopy). Membran protein dalam detergen/lemak micellesmenghasilkan sedikit resonansi NMR dan signal overlap berkurang daripada protein globular dari massa molekuler yang sama. Walaupun molekul detergen dapat menunjukkan fraksi yang besar dari keseluruhan massa yang besar dari pencampuran micelles, pelabelan isotop yang sesuai seperti tanda 13C, 15N dari protein dan atau menggunakan detergen deuterasi, memastikan bahwa signal NMR protein dapat dideteksi dengan besar atau tanpa interferensi darisignal molekul detergen.